Ruolo della via Ras-ERK nella dipendenza ai cannabinoidi

in un recente lavoro Valjent e collaboratori (Valjent E. et al. 2001 Eur. J. Neurosci. 14, 342-352) hanno dimostrato che la somministrazione di THC nel topo induce una transiente attivazione di ERK localizzata nello striato dorsale e nel nucleo accumbens. Tale effetto è strettamente dipendente dall’attivazione del recettore CB1 come evidenziato dalla sua sensibilità all’antagonista selettivo SR141716A. Inoltre il THC induce la fosforilazione del fattore di trascrizione Elk-1, il quale rappresenta il maggior target nucleare di ERK e tale effetto risulta bloccato dalla somministrazione in vivo del composto SL327, un inibitore specifico delle MAPK/ERK kinasi. Queste prime evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo importante per la via di MAP/ERK kinasi nella mediazione degli effetti dei cannabinoidi, ma nulla al momento è conosciuto sul ruolo di tale cammino nei processi di esposizione a lungo termine alla droga. Scopo principale del progetto della presente unità operativa è quello di indagare il ruolo della via Ras-ERK kinasi nei fenomeni di tolleranza, dipendenza fisica e sensitizzazione ai cannabinoidi. La possibilità di eseguire studi su topi geneticamente modificati nella loro capacità di attivare la via ras-ERK fornitici dall’unità coordinata dalla Prof.ssa Zippel, rappresenta un valido strumento per definire l’importanza di tale cammino intracellulare. In particolare ci avvarremo di topi knock out per il gene ras-GRF1 che codifica per lo scambiatore deputato all’attivazione delle proteine ras che a loro volta rappresentano l’interruttore molecolare che porta all’attivazione sequenziale dei membri appartenenti alla cascata della via MAP/ERK kinasi. Tale scambiatore è specificatamente attivato dai recettori accoppiati a G proteine a cui il recettore cannabico CB1 appartiene. Più dettagliatamente, il lavoro della presente unità operativa sarà così sviluppato: 1) analisi dell’effetto della somministrazione di dosi crescenti di THC e/o di CP-55,940 per via sottocutanea in topi ras-GRF1 knock out e wild type mediante valutazione di due classici effetti cannabici, quali l’analgesia e la riduzione dell’attività locomotoria, testati rispettivamente mediante il test del tail flick e l’uso di una gabbia di attività locomotoria. 2) Studio della cinetica dello sviluppo della tolleranza agli effetti analgesici e di riduzione dell’attività locomotoria dopo somministrazione ripetuta di THC e/o CP-55,940 in topi wild type e knock out. 3) valutazione della sindrome astinenziale precipitata mediante somministrazione dell’antagonista del recettore cannabico centrale CB1 SR141716 in topi knock out e wild type trattati cronicamente con THC e/o CP-55,940. A tale scopo verrà utilizzato un protocollo di analisi comportamentale precedentemente messo a punto per la sindrome astinenziale da cannabinoidi (Aceto et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, 1290-1295, 1996). 4) valutazione della presenza del fenomeno della sensitizzazione comportamentale al THC e/o al CP-55,940 in topi knock out e wild type. A tale scopo topi trattati cronicamente con i cannabinoidi verranno riesposti ad una dose soglia di THC e/o CP-55,940 dopo un lungo intervallo di sospensione dalla droga stessa e sottoposti ad analisi comportamentale verificando la presenza di comportamenti specifici della sensitizzazione da cannabinoidi (stereotipie, attività esplorativa). 5) studio in topi wild type dell’effetto della somministrazione in vivo di SL327, inibitore selettivo di MAPK/ERK kinasi sullo sviluppo delle sopracitate risposte acute e croniche ai cannabinoidi. 6) valutazione dell’attivazione dei più comuni fattori di trascrizione correlati alla fosforilazione di ERK e/o attivati dal signalling del recettore cannabico nelle diverse aree cerebrali di topi knock out e wild type dopo trattamento acuto e cronico. In particolare i cervelli verranno rapidamente prelevati dagli animali trattati e le aree cerebrali dissezionate seguendo le coordinate stereotassiche dell’atlante di Franklin and Paxinos ("The mouse brain in stereotaxic coordinates", New York, Academic Press,1996)al fine di preparare estratti nucleari in cui valutare l’attività di fattori di trascrizione quali cfos, fos B, c-jun, Elk-1 e CREB. A tale scopo verranno impiegati kit ELISA disponibili commercialmente che utilizzano specifici anticorpi diretti contro la forma fosforilata (attivata) di tali fattori e identificabili mediante anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) che permette una reazione colorimetrica facilmente quantificabile tramite l’uso di uno spettrofotometro