Per identificare quali siano le aree cerebrali maggiormente coinvolte nella mediazione degli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi abbiamo microiniettato dosi crescenti di THC in diverse regioni cerebrali di ratto scelte sia in base alla presenza di buone densità di recettori CB1 che per il ruolo svolto nella mediazione del comportamento emotivo, quali la corteccia prefrontale, l’amigdala, l’ippocampo ed il nucleus accumbens. Le somministrazioni intracerebrali sono state effettuate tramite microcannule inserite nell’area d’interesse utilizzando uno strumento stereotassico per roditori. Dopo 30 minuti dall’iniezione di THC, gli animali sono stati sottoposti al test d’ansia dell’elevated plus-maze che si basa sul conflitto provato dall’animale tra la propensione ad esplorare un ambiente nuovo e l’inibizione a farlo a causa delle sue caratteristiche avversive. I principali parametri considerati come misura dello stato d’ansia sono rappresentati dalla percentuale di tempo trascorso nei bracci aperti del labirinto e dalla percentuale di entrate effettuate in tali bracci; in particolare si assume che tali parametri siano incrementati dai composti ansiolitici e diminuiti dalle sostanze ansiogeniche. Il numero di entrate nei bracci chiusi del labirinto rappresenta invece un indice dell’attività locomotoria dell’animale. Attraverso questo saggio comportamentale abbiamo dimostrato un effetto ansiolitico di basse dosi di THC (1/10mg, a seconda dell’area considerata) iniettato in corteccia prefrontale, nucleus accumbens e ippocampo ventrale, mentre nessuna variazione dei parametri considerati è stata osservata dopo microiniezioni in ippocampo dorsale. Al contrario, iniezioni di basse dosi di THC in amigdala basolaterale e centrale (1mg) hanno prodotto un effetto ansiogenico. E’ stata inoltre saggiata la capacità dell’AM251, antagonista cannabico selettivo per il recettore CB1, di antagonizzare gli effetti ansiolitici/ansiogenici del THC. A questo scopo, sono state effettuate microiniezioni di antagonista cannabico da solo e in associazione con l’agonista in tutte le aree cerebrali considerate. In corteccia prefrontale e in ippocampo l’AM251 di per sé non produce nessun effetto comportamentale ma antagonizza pienamente l’effetto ansiolitico del THC. Similmente, iniezioni di AM251 in amigdala basolaterale di per sé non alterano il comportamento ansioso degli animali ma antagonizzano pienamente l’effetto ansiogenico del THC. Nell’insieme i nostri dati depongono a favore di un coinvolgimento dei recettori cannabici CB1 presenti nella corteccia prefrontale, nell’amigdala basolaterale e centrale, nell’ippocampo ventrale e nel nucleus accumbens nella modulazione degli stati ansiosi, ma il loro ruolo sembra essere diverso a seconda dell’area cerebrale considerata. Per definire i cammini cellulari coinvolti negli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi, sui cervelli degli animali microiniettati nelle diverse aree cerebrali od iniettati per via intraperitoneale con dosi ansiolitiche di THC (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala) sono stati condotti saggi biochimici volti a definire lo stato di attivazione di CREB. CREB è un fattore di trascrizione recentemente chiamato in causa anche nella modulazione degli stati d’ansia. L’inibizione dell’attivazione di CREB nel nucleus accumbens sembra infatti associato ad un incremento dei comportamenti d’ansia (Barrot et al., PNAS 2002) mentre la ridotta fosforilazione di CREB nel nucleo centrale dell’amigdala è correlata all’ansia che si manifesta nell’astinenza da alcool (Pandey, TIPS 2003). La microiniezione di una dose ansiolitica di THC nella corteccia prefrontale e nell’ippocampo ventrale induce un significativo aumento nella quota di CREB fosforilato (e quindi attivato), mentre la microiniezione di una dose ansiogenica di THC nell’amigdala basolaterale riduce significativamente la fosforilazione di CREB. Tutti questi eventi vengono specificatamente prevenuti dal pretrattamento con l’antagonista AM251, ad indicare il chiaro coinvolgimento del recettore CB1 nella produzione di tali effetti. La stretta correlazione tra la modulazione dell’attivazione di CREB e la risposta ansiolitica/ansiogenica del THC suggerisce che trascritti CREB-dipendenti potrebbero essere coinvolti nella modulazione dei comportamenti ansiosi indotta dal THC. Negli animali iniettati perifericamente con dosi ansiolitiche di THC (0.75 mg/kg i.p., test dell’elevated plus maze) si osserva un incremento significativo dei livelli di CREB attivato sia nella corteccia prefrontale che nell’ippocampo. Questi incrementi sono reversati dal pretrattamento con AM251. Sulla base di questo risultato abbiamo indagato i cammini cellulari modulati dalla stimolazione del recettore CB1 che potevano portare all’attivazione di CREB. E’ noto che esistono diversi siti di fosforilazione su CREB che regolano in modo differente la sua attività: la fosforilazione in serina 133 ad opera della PKA, della CAMKIV e della RSK attivata da ERK, attiva la trascrizione genica, mentre la fosforilazione a livello della serina 142, ad opera della CAMKII, inibisce la trascrizione (Carlezon et al., TINS 28, 2005). Nell’ippocampo l’analisi delle attività delle kinasi PKA, ERK e CAMKII dopo trattamento con THC ed esposizione dell’animale al plus maze rivela una significativa riduzione solo nell’attività della CAMKII che potrebbe giustificare l’incremento di CREB attivato indotto dal THC in quest’area. Nella corteccia prefrontale, invece, l’incremento dell’attivazione di ERK sembra essere responsabile dell’aumentato livello di CREB fosforilato. Questo risultato è stato ulteriormente corroborato da esperimenti con SL327, l’inibitore selettivo di MEK, la chinasi a monte di ERK e responsabile della sua attivazione, microiniettato nella corteccia prefrontale. Negli animali pretrattati con SL327, il THC non è in grado né di esplicare il suo effetto ansiolitico, né di incrementare i livelli di CREB fosforilato. Nell’insieme i nostri dati suggeriscono che l’alterazione dell’attivazione di CREB sembra essere un evento fondamentale nella regolazione degli stati d’ansia da parte del sistema cannabico. Tale modulazione viene innescata dalla stimolazione del recettore cannabico CB1 seguito da una cascata di segnale differente (cascata di ERK o CAMKII) a seconda dell’area cerebrale considerata. Infine, per studiare il ruolo del tono cannabico endogeno nella modulazione degli stati d’ansia, abbiamo modulato i livelli di anandamide nella corteccia prefrontale dei ratti attraverso approcci multidisciplinari. Abbiamo scelto di condurre questi studi nella corteccia prefrontale in quanto è un’area notoriamente coinvolta nella modulazione dei comportamenti ansiosi e negli studi da noi condotti sopra citati è stata l’area cerebrale maggiormente responsiva al THC. In un primo approccio di tipo farmacologico sono state microiniettate direttamente in corteccia prefrontale di ratto differenti dosi di meta-anandamide (0.1 – 10 µg), l’analogo stabile dell’anandamide, per analizzare l’effetto di un incremento nei livelli dell’endocannabinoide sullo stato d’ansia. Gli effetti di microiniezioni di meta-anandamide sull’ansia sembrano essere bifasici: basse dosi (0.1 µg) producono un effetto ansiolitico, mentre alte dosi (10 µg) mostrano un effetto ansiogenico. Il pretrattamento con l’antagonista selettivo AM251 antagonizza l’effetto ansiolitico prodotto da basse dosi di anandamide ma non quello ansiogenico, suggerendo che quest’ultimo effetto possa essere dovuto al coinvolgimento di recettori diversi dal CB1. A tale proposito poiché è noto dalla letteratura che l’anandamide può agire da agonista sui recettori vanilloidi, abbiamo testato l’effetto di un pretrattamento con capsazepina, antagonista del recettore dei vanilloidi TRPV1, sull’effetto ansiogenico dovuto alla dose più elevata dell’endocannabinoide: la scomparsa di tale effetto supporta un ruolo dei recettori TRPV1 nella produzione della risposta ansiogenica indotta da alte dosi di anandamide. L’insieme di questi dati suggerisce l’esistenza di un fine sistema di regolazione del tono cannabico endogeno, molto sensibile a lievi variazioni nei livelli fisiologici di endocannabinoidi. In accordo con questa ipotesi sono anche i risultati da noi ottenuti modulando farmacologicamente i livelli dell’enzima deputato alla degradazione dell’anandamide, la FAAH. L’inibizione selettiva e irreversibile di questo enzima attraverso microiniezioni del composto URB597 in corteccia prefrontale ha indotto un significativo effetto ansiolitico nel test dell’elevated plus maze dopo microiniezione di basse dosi di URB (0.01µg ) in grado di produrre una inibizione dell’attività enzimatica pari al 30%, mentre dosi più elevate perdono tale effetto o addirittura inducono un profilo ansiogenico. La rilevanza del tono endocannabico nella corteccia prefrontale nella modulazione dei comportamenti ansiosi è stata ulteriormente indagata utilizzando un approccio genetico volto ad aumentare i livelli di FAAH mediante tecniche di trasferimento genico in vivo basate su vettori lentivirali contenenti il cDNA codificante per l’enzima FAAH. Questo approccio può essere diviso in due fasi, la prima riguardante la produzione del vettore e la seconda la sua microiniezione in corteccia prefrontale Produzione del vettore lentivirale contenente la sequenza di cDNA per FAAH Per gli esperimenti di trasduzione della sequenza di cDNA codificante per la FAAH, è stato adottato un sistema lentivirale di seconda generazione, composto dai tre vettori pCMVDR8.74, pMD2.G e pWPT/GFP. Il vettore pWPT/GFP è stato successivamente modificato per ottenere tre diversi costrutti in grado di assicurare in modo ottimale l’espressione simultanea sia di FAAH che della proteina reporter EGFP. Per sviluppare tali vettori lentivirali dualgenici sono state testate le seguenti strategie: 1. uso di promotori interni per assicurare la trascrizione indipendente sia di FAAH che di EGFP; 2. uso della sequenza IRES di Encephalomyocarditis Virus per permettere l’espressione delle due ORFs sullo stesso mRNA; 3. uso della sequenza insulator cHS4 per segregare i cDNA codificanti rispettivamente FAAH e EGFP in domini indipendenti, in modo da contrastare la soppressione dell’espressione della sequenza a valle, dovuta a fenomeni di interferenza trascrizionale. Ciascuno dei vettori di trasferimento genico, pWPT/GFP, pWPT/FAAH/GFP pWPT/FAAH/IRES/GFP e pWPT/FAAH/HS4/GFP, è stato cotransfettato con il costrutto di packaging pCMVDR8.74 e con il plasmide pMD2.G in cellule epiteliali renali di embrione umano 293 FT, per produrre particelle lentivirali pseudotipizzate incompetenti per la replicazione, contenenti l’RNA ricombinante di interesse, successivamente trasdotte in cellule di glioma di ratto C6. L’analisi mediante Western Immunoblot ha mostrato un significativo aumento dei livelli di espressione (400%) della FAAH sia rispetto alla linea parentale C6/WT che alla linea mock-infettata C6/WPT/GFP; i livelli di sovraespressione sono simili nelle tre linee cellulari sovraesprimenti la sequenza di interesse, trasdotte con i vettori pWPT/FAAH/GFP pWPT/FAAH/IRES/GFP e pWPT/FAAH/HS4/GFP. Le cellule trasdotte con la sequenza codificante per la FAAH mostrano inoltre un’attività dell’enzima pari a 10 volte quella delle corrispondenti cellule di controllo parentali o mock-infettate con il vettore pWPT/GFP. Per quanto riguarda il pattern di espressione della proteina EGFP, il vettore pWPT/FAAH/HS4/GFP assicura un’espressione massimale del gene reporter. Tale vettore è stato quindi destinato alle successive fasi della ricerca (trasduzione in vivo). Microiniezioni in vivo del vettore lentivirale Tramite l’utilizzo di un apparecchio stereotassico per roditori, sono stati microiniettati in corteccia prefrontale bilateralmente 3 µl di sospensione virale ed è stata poi eseguita sia un’analisi biochimica atta a valutare la bontà della trasduzione in vivo 7 giorni dopo la microiniezione che l’analisi comportamentale. Il saggio di western immunoblotting ha dimostrato l’effettiva sovraespressione (120%) della proteina FAAH nel gruppo degli animali trasdotto con il vettore lentivirale contenente il cDNA codificante per l’enzima rispetto sia ad un gruppo controllo iniettato con la sola soluzione fisiologica che ad un gruppo “mock” iniettato con il vettore vuoto. Questo risultato è stato confermato anche da studi condotti in immunofluorescenza sulle sezioni cerebrali dei ratti appartenenti ai diversi gruppi sperimentali contenenti il sito di inoculo. Il saggio dell’attività enzimatica ha dimostrato un parallelo incremento di attività della FAAH nel gruppo trasdotto con il vettore lentivirale (90%) rispetto sia agli animali controllo che ai mock. Infine, gli animali trasdotti con il vettore lentivirale presentano anche una drastica riduzione nei livelli di anandamide in corteccia prefrontale rispetto ai controlli. L’analisi comportamentale condotta a 7 giorni sui ratti trasdotti con il vettore lentivirale contenente la FAAH non ha evidenziato alcuna alterazione nell’attività locomotoria spontanea nei diversi gruppi di animali, ma ha dimostrato la presenza di un significativo effetto ansiogenico (elevated plus maze). In conclusione i risultati ottenuti suggeriscono che nella corteccia prefrontale l’anandamide può svolgere un ruolo chiave nella regolazione degli stati ansiosi, mostrando un effetto bifasico. In particolare leggeri incrementi nei livelli di anandamide inducono un effetto ansiolitico, mentre ridotti contenuti o un eccessivo incremento nel suo contenuto possono portare alla comparsa di un profilo ansiogenico.
Cannabinoidi ed ansia: meccanismi cellulari/molecolari e ruolo degli endocannabinoidi nella modulazione degli stati ansiosi
RUBINO, TIZIANA
2004-01-01
Abstract
Per identificare quali siano le aree cerebrali maggiormente coinvolte nella mediazione degli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi abbiamo microiniettato dosi crescenti di THC in diverse regioni cerebrali di ratto scelte sia in base alla presenza di buone densità di recettori CB1 che per il ruolo svolto nella mediazione del comportamento emotivo, quali la corteccia prefrontale, l’amigdala, l’ippocampo ed il nucleus accumbens. Le somministrazioni intracerebrali sono state effettuate tramite microcannule inserite nell’area d’interesse utilizzando uno strumento stereotassico per roditori. Dopo 30 minuti dall’iniezione di THC, gli animali sono stati sottoposti al test d’ansia dell’elevated plus-maze che si basa sul conflitto provato dall’animale tra la propensione ad esplorare un ambiente nuovo e l’inibizione a farlo a causa delle sue caratteristiche avversive. I principali parametri considerati come misura dello stato d’ansia sono rappresentati dalla percentuale di tempo trascorso nei bracci aperti del labirinto e dalla percentuale di entrate effettuate in tali bracci; in particolare si assume che tali parametri siano incrementati dai composti ansiolitici e diminuiti dalle sostanze ansiogeniche. Il numero di entrate nei bracci chiusi del labirinto rappresenta invece un indice dell’attività locomotoria dell’animale. Attraverso questo saggio comportamentale abbiamo dimostrato un effetto ansiolitico di basse dosi di THC (1/10mg, a seconda dell’area considerata) iniettato in corteccia prefrontale, nucleus accumbens e ippocampo ventrale, mentre nessuna variazione dei parametri considerati è stata osservata dopo microiniezioni in ippocampo dorsale. Al contrario, iniezioni di basse dosi di THC in amigdala basolaterale e centrale (1mg) hanno prodotto un effetto ansiogenico. E’ stata inoltre saggiata la capacità dell’AM251, antagonista cannabico selettivo per il recettore CB1, di antagonizzare gli effetti ansiolitici/ansiogenici del THC. A questo scopo, sono state effettuate microiniezioni di antagonista cannabico da solo e in associazione con l’agonista in tutte le aree cerebrali considerate. In corteccia prefrontale e in ippocampo l’AM251 di per sé non produce nessun effetto comportamentale ma antagonizza pienamente l’effetto ansiolitico del THC. Similmente, iniezioni di AM251 in amigdala basolaterale di per sé non alterano il comportamento ansioso degli animali ma antagonizzano pienamente l’effetto ansiogenico del THC. Nell’insieme i nostri dati depongono a favore di un coinvolgimento dei recettori cannabici CB1 presenti nella corteccia prefrontale, nell’amigdala basolaterale e centrale, nell’ippocampo ventrale e nel nucleus accumbens nella modulazione degli stati ansiosi, ma il loro ruolo sembra essere diverso a seconda dell’area cerebrale considerata. Per definire i cammini cellulari coinvolti negli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi, sui cervelli degli animali microiniettati nelle diverse aree cerebrali od iniettati per via intraperitoneale con dosi ansiolitiche di THC (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala) sono stati condotti saggi biochimici volti a definire lo stato di attivazione di CREB. CREB è un fattore di trascrizione recentemente chiamato in causa anche nella modulazione degli stati d’ansia. L’inibizione dell’attivazione di CREB nel nucleus accumbens sembra infatti associato ad un incremento dei comportamenti d’ansia (Barrot et al., PNAS 2002) mentre la ridotta fosforilazione di CREB nel nucleo centrale dell’amigdala è correlata all’ansia che si manifesta nell’astinenza da alcool (Pandey, TIPS 2003). La microiniezione di una dose ansiolitica di THC nella corteccia prefrontale e nell’ippocampo ventrale induce un significativo aumento nella quota di CREB fosforilato (e quindi attivato), mentre la microiniezione di una dose ansiogenica di THC nell’amigdala basolaterale riduce significativamente la fosforilazione di CREB. Tutti questi eventi vengono specificatamente prevenuti dal pretrattamento con l’antagonista AM251, ad indicare il chiaro coinvolgimento del recettore CB1 nella produzione di tali effetti. La stretta correlazione tra la modulazione dell’attivazione di CREB e la risposta ansiolitica/ansiogenica del THC suggerisce che trascritti CREB-dipendenti potrebbero essere coinvolti nella modulazione dei comportamenti ansiosi indotta dal THC. Negli animali iniettati perifericamente con dosi ansiolitiche di THC (0.75 mg/kg i.p., test dell’elevated plus maze) si osserva un incremento significativo dei livelli di CREB attivato sia nella corteccia prefrontale che nell’ippocampo. Questi incrementi sono reversati dal pretrattamento con AM251. Sulla base di questo risultato abbiamo indagato i cammini cellulari modulati dalla stimolazione del recettore CB1 che potevano portare all’attivazione di CREB. E’ noto che esistono diversi siti di fosforilazione su CREB che regolano in modo differente la sua attività: la fosforilazione in serina 133 ad opera della PKA, della CAMKIV e della RSK attivata da ERK, attiva la trascrizione genica, mentre la fosforilazione a livello della serina 142, ad opera della CAMKII, inibisce la trascrizione (Carlezon et al., TINS 28, 2005). Nell’ippocampo l’analisi delle attività delle kinasi PKA, ERK e CAMKII dopo trattamento con THC ed esposizione dell’animale al plus maze rivela una significativa riduzione solo nell’attività della CAMKII che potrebbe giustificare l’incremento di CREB attivato indotto dal THC in quest’area. Nella corteccia prefrontale, invece, l’incremento dell’attivazione di ERK sembra essere responsabile dell’aumentato livello di CREB fosforilato. Questo risultato è stato ulteriormente corroborato da esperimenti con SL327, l’inibitore selettivo di MEK, la chinasi a monte di ERK e responsabile della sua attivazione, microiniettato nella corteccia prefrontale. Negli animali pretrattati con SL327, il THC non è in grado né di esplicare il suo effetto ansiolitico, né di incrementare i livelli di CREB fosforilato. Nell’insieme i nostri dati suggeriscono che l’alterazione dell’attivazione di CREB sembra essere un evento fondamentale nella regolazione degli stati d’ansia da parte del sistema cannabico. Tale modulazione viene innescata dalla stimolazione del recettore cannabico CB1 seguito da una cascata di segnale differente (cascata di ERK o CAMKII) a seconda dell’area cerebrale considerata. Infine, per studiare il ruolo del tono cannabico endogeno nella modulazione degli stati d’ansia, abbiamo modulato i livelli di anandamide nella corteccia prefrontale dei ratti attraverso approcci multidisciplinari. Abbiamo scelto di condurre questi studi nella corteccia prefrontale in quanto è un’area notoriamente coinvolta nella modulazione dei comportamenti ansiosi e negli studi da noi condotti sopra citati è stata l’area cerebrale maggiormente responsiva al THC. In un primo approccio di tipo farmacologico sono state microiniettate direttamente in corteccia prefrontale di ratto differenti dosi di meta-anandamide (0.1 – 10 µg), l’analogo stabile dell’anandamide, per analizzare l’effetto di un incremento nei livelli dell’endocannabinoide sullo stato d’ansia. Gli effetti di microiniezioni di meta-anandamide sull’ansia sembrano essere bifasici: basse dosi (0.1 µg) producono un effetto ansiolitico, mentre alte dosi (10 µg) mostrano un effetto ansiogenico. Il pretrattamento con l’antagonista selettivo AM251 antagonizza l’effetto ansiolitico prodotto da basse dosi di anandamide ma non quello ansiogenico, suggerendo che quest’ultimo effetto possa essere dovuto al coinvolgimento di recettori diversi dal CB1. A tale proposito poiché è noto dalla letteratura che l’anandamide può agire da agonista sui recettori vanilloidi, abbiamo testato l’effetto di un pretrattamento con capsazepina, antagonista del recettore dei vanilloidi TRPV1, sull’effetto ansiogenico dovuto alla dose più elevata dell’endocannabinoide: la scomparsa di tale effetto supporta un ruolo dei recettori TRPV1 nella produzione della risposta ansiogenica indotta da alte dosi di anandamide. L’insieme di questi dati suggerisce l’esistenza di un fine sistema di regolazione del tono cannabico endogeno, molto sensibile a lievi variazioni nei livelli fisiologici di endocannabinoidi. In accordo con questa ipotesi sono anche i risultati da noi ottenuti modulando farmacologicamente i livelli dell’enzima deputato alla degradazione dell’anandamide, la FAAH. L’inibizione selettiva e irreversibile di questo enzima attraverso microiniezioni del composto URB597 in corteccia prefrontale ha indotto un significativo effetto ansiolitico nel test dell’elevated plus maze dopo microiniezione di basse dosi di URB (0.01µg ) in grado di produrre una inibizione dell’attività enzimatica pari al 30%, mentre dosi più elevate perdono tale effetto o addirittura inducono un profilo ansiogenico. La rilevanza del tono endocannabico nella corteccia prefrontale nella modulazione dei comportamenti ansiosi è stata ulteriormente indagata utilizzando un approccio genetico volto ad aumentare i livelli di FAAH mediante tecniche di trasferimento genico in vivo basate su vettori lentivirali contenenti il cDNA codificante per l’enzima FAAH. Questo approccio può essere diviso in due fasi, la prima riguardante la produzione del vettore e la seconda la sua microiniezione in corteccia prefrontale Produzione del vettore lentivirale contenente la sequenza di cDNA per FAAH Per gli esperimenti di trasduzione della sequenza di cDNA codificante per la FAAH, è stato adottato un sistema lentivirale di seconda generazione, composto dai tre vettori pCMVDR8.74, pMD2.G e pWPT/GFP. Il vettore pWPT/GFP è stato successivamente modificato per ottenere tre diversi costrutti in grado di assicurare in modo ottimale l’espressione simultanea sia di FAAH che della proteina reporter EGFP. Per sviluppare tali vettori lentivirali dualgenici sono state testate le seguenti strategie: 1. uso di promotori interni per assicurare la trascrizione indipendente sia di FAAH che di EGFP; 2. uso della sequenza IRES di Encephalomyocarditis Virus per permettere l’espressione delle due ORFs sullo stesso mRNA; 3. uso della sequenza insulator cHS4 per segregare i cDNA codificanti rispettivamente FAAH e EGFP in domini indipendenti, in modo da contrastare la soppressione dell’espressione della sequenza a valle, dovuta a fenomeni di interferenza trascrizionale. Ciascuno dei vettori di trasferimento genico, pWPT/GFP, pWPT/FAAH/GFP pWPT/FAAH/IRES/GFP e pWPT/FAAH/HS4/GFP, è stato cotransfettato con il costrutto di packaging pCMVDR8.74 e con il plasmide pMD2.G in cellule epiteliali renali di embrione umano 293 FT, per produrre particelle lentivirali pseudotipizzate incompetenti per la replicazione, contenenti l’RNA ricombinante di interesse, successivamente trasdotte in cellule di glioma di ratto C6. L’analisi mediante Western Immunoblot ha mostrato un significativo aumento dei livelli di espressione (400%) della FAAH sia rispetto alla linea parentale C6/WT che alla linea mock-infettata C6/WPT/GFP; i livelli di sovraespressione sono simili nelle tre linee cellulari sovraesprimenti la sequenza di interesse, trasdotte con i vettori pWPT/FAAH/GFP pWPT/FAAH/IRES/GFP e pWPT/FAAH/HS4/GFP. Le cellule trasdotte con la sequenza codificante per la FAAH mostrano inoltre un’attività dell’enzima pari a 10 volte quella delle corrispondenti cellule di controllo parentali o mock-infettate con il vettore pWPT/GFP. Per quanto riguarda il pattern di espressione della proteina EGFP, il vettore pWPT/FAAH/HS4/GFP assicura un’espressione massimale del gene reporter. Tale vettore è stato quindi destinato alle successive fasi della ricerca (trasduzione in vivo). Microiniezioni in vivo del vettore lentivirale Tramite l’utilizzo di un apparecchio stereotassico per roditori, sono stati microiniettati in corteccia prefrontale bilateralmente 3 µl di sospensione virale ed è stata poi eseguita sia un’analisi biochimica atta a valutare la bontà della trasduzione in vivo 7 giorni dopo la microiniezione che l’analisi comportamentale. Il saggio di western immunoblotting ha dimostrato l’effettiva sovraespressione (120%) della proteina FAAH nel gruppo degli animali trasdotto con il vettore lentivirale contenente il cDNA codificante per l’enzima rispetto sia ad un gruppo controllo iniettato con la sola soluzione fisiologica che ad un gruppo “mock” iniettato con il vettore vuoto. Questo risultato è stato confermato anche da studi condotti in immunofluorescenza sulle sezioni cerebrali dei ratti appartenenti ai diversi gruppi sperimentali contenenti il sito di inoculo. Il saggio dell’attività enzimatica ha dimostrato un parallelo incremento di attività della FAAH nel gruppo trasdotto con il vettore lentivirale (90%) rispetto sia agli animali controllo che ai mock. Infine, gli animali trasdotti con il vettore lentivirale presentano anche una drastica riduzione nei livelli di anandamide in corteccia prefrontale rispetto ai controlli. L’analisi comportamentale condotta a 7 giorni sui ratti trasdotti con il vettore lentivirale contenente la FAAH non ha evidenziato alcuna alterazione nell’attività locomotoria spontanea nei diversi gruppi di animali, ma ha dimostrato la presenza di un significativo effetto ansiogenico (elevated plus maze). In conclusione i risultati ottenuti suggeriscono che nella corteccia prefrontale l’anandamide può svolgere un ruolo chiave nella regolazione degli stati ansiosi, mostrando un effetto bifasico. In particolare leggeri incrementi nei livelli di anandamide inducono un effetto ansiolitico, mentre ridotti contenuti o un eccessivo incremento nel suo contenuto possono portare alla comparsa di un profilo ansiogenico.
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