Compito della nostra unità di ricerca è stato quello di testare l’ipotesi di una possibile interazione della salvinorina A con il sistema cannabico. Questo scopo è stato perseguito tramite due differenti approcci sperimentali: in un primo momento sono stati eseguiti diversi saggi in vitro, atti ad identificare una possibile interazione diretta od indiretta tra la Salvinorina ed il recettore cannabico centrale CB1, nonché tra la salvinorina e la FAAH, l’enzima deputato alla degradazione del principale cannabinoide endogeno, l’anandamide. In un secondo momento, sui cervelli provenienti da animali trattati con salvinorina (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala), abbiamo valutato la capacità della salvinorina in vivo di alterare l’attività della FAAH, nonché quali fossero le aree cerebrali la cui attività neuronale fosse modulata dalla somministrazione in vivo di salvinorina. STUDI IN VITRO Sebbene una procedura di screening su cellule transfettate sembra indicare che la salvinorina A non è in grado di legare il recettore cannabico CB1, non esistono a tutt'oggi lavori di binding condotti su membrane cerebrali che confermino o meno tale risultato. Per studiare quindi la possibile esistenza di una interazione tra la Salvinorina A e il recettore cannabico centrale CB1 è stato condotto un saggio di binding di competizione, dove differenti concentrazioni di Salvinorina A competono per il legame con i recettori CB1 con una concentrazione fissa dell’agonista selettivo ad alta affinità [3H]CP-55,940 (1 nM). Le membrane sono state preparate dall’area striatale di ratti maschi Wistar, in quanto tale regione cerebrale contiene sia i recettori CB1 che i recettori k oppioidi. Per controllare la bontà delle condizioni sperimentali utilizzate, la competizione è stata condotta anche con concentrazioni crescenti di CP-55,940 non marcato e di un agonista k-oppioide, la spiradolina. Come atteso, le concentrazioni crescenti di CP-55,940 non marcato (da 1pM a 3μM) competono con l’agonista triziato per il legame al recettore CB1, ad ottenere una tipica curva di spiazzamento ad un sito di competizione con una IC50 di 3,9 nM (concentrazione di agonista che inibisce il 50% del binding specifico). Al contrario, concentrazioni crescenti di spiradolina (da 100 pM a 300 μM) non sono in grado di competere con il ligando triziato per il legame con il recettore CB1. Infatti nonostante si sia arrivati ad un eccesso molare di 300000 volte (300 μM di spiradolina vs 1 nM di [3H]CP-55,940), non si osserva nessun effetto significativo sul binding specifico del CP-55,940 triziato, ad indicare che il recettore CB1 non è un sito di legame della spiradolina, essendo questa un agonista selettivo del recettore κ-oppioide. Quando lo stesso esperimento viene condotto con concentrazioni crescenti di Salvinorina A, questo composto non presenta nessun effetto sul binding specifico del [3H]CP-55,940 fino alla concentrazione 10 μM, mentre a concentrazioni superiori (da 30 μM a 1 mM) compete con il ligando triziato per il legame al recettore CB1. La concentrazione di Salvinorina A che produce il 50% di inibizione del binding specifico è molto elevata (IC50 = 457.2 mM), suggerendo che forse questa interazione non è rilevante in quanto difficilmente raggiungibile in vivo. Inoltre in letteratura è riportato che l’SR141716A, antagonista selettivo dei recettori CB1, è in grado di antagonizzare l’effetto gratificante di basse dosi di Salvinorina A (Braida et al., 2007; 2008) mentre noi abbiamo evidenziato il legame di Salvinorina A al recettore CB1 solo a concentrazioni molto elevate. Poiché sia i recettori cannabici CB1 che κ-oppioidi sono accoppiati a G proteine per la trasduzione del segnale, abbiamo poi valutato la capacità della Salvinorina A di attivare tale via di trasduzione attraverso il saggio di binding del [35S]GTPγS condotto in autoradiografia. Abbiamo poi confrontato il quadro di attivazione della Salvinorina A con quello indotto da agonisti selettivi per il recettore CB1 (CP 55-940) e k oppioidi (spiradolina). A tale scopo, sezioni coronali a livello dell’area striatale sono state prima incubate con differenti concentrazioni di Salvinorina A (da 2.5 pM a 30 μM) per verificare con quale concentrazione questo composto fosse in grado di stimolare l’attività delle G proteine. La concentrazione più elevata di Salvinorina A (30 μM) era in grado di indurre una stimolazione del legame del [35S]GTPγS significativa (40%) rispetto alla sezione in assenza di stimolo, per cui abbiamo utilizzato tale concentrazione per le ulteriori indagini. Per indagare il coinvolgimento dei singoli recettori nell’attivazione delle G proteine stimolata da Salvinorina A, abbiamo condotto lo stesso saggio incubando la Salvinorina A 30 μM con i due rispettivi antagonisti, la nor-BNI 1 μM per il recettore κ-oppioide e SR141716A 10 μM per quello cannabico. A scopo comparativo abbiamo infine condotto lo stesso saggio stimolando l’attivazione delle G proteine con l’agonista selettivo per il recettore CB1 (CP-55,940 5 μM) e per quello κ-oppioide (spiradolina 10 μM). Come atteso, il CP-55,940 induce una stimolazione dell’attività del recettore cannabico nello striato del 76% rispetto alla sezione non stimolata, mentre la spiradolina produce una stimolazione dell’attività del recettore κ-oppioide del 38%. Questa differenza nella stimolazione delle G proteine è in linea con i dati di binding recettoriale presenti in letteratura che dimostrano come i recettori cannabici siano maggiormente espressi rispetto a quelli κ-oppioidi nell’area striatale (Tempel e Zukin, 1987; Herkenam et al., 1991; Rubino et al., 2003). La Salvinorina A induce una stimolazione delle G proteine del 36% (vs. non stimolato) ma quando incubata in vitro con la nor-BNI tale stimolazione si riduce e non è più significativamente differente dalla sezione non stimolata, dimostrando che il blocco farmacologico del recettore κ-oppioide previene la trasduzione del segnale da Salvinorina A. Quando invece questa è incubata con l’SR141716A la stimolazione è del 47%, simile a quella indotta dalla sola Salvinorina A, suggerendo che il blocco farmacologico del recettore cannabico non altera la stimolazione delle G proteine e che quindi tale sostanza a questa concentrazione attiva solo il recettore κ-oppioide. Dai risultati del binding recettoriale e del binding del [35S]GTPγS risulta quindi che la Salvinorina A si lega preferibilmente ai recettori κ-oppioidi. Poiché molto recentemente è stato scoperto che il recettore CB1, come molti altri recettori accoppiati a G proteine, contiene un sito di legame allosterico (Ross, 2007), da ultimo è stata valutata la capacità della salvinorina di agire come modulatore allosterico di questo recettore. Questa ipotesi è avvalorata dal fatto che è stato scoperto che la salvinorina può agire come modulatore allosterico del recettore oppiaceo mu (Rothman et al., 2007). A questo scopo abbiamo utilizzato nuovamente il saggio di binding del [35S]GTPγS stimolando con diverse concentrazioni dell’agonista cannabico CP-55,940 (2microM e 5microM) da solo o in coincubazione con salvinorina A (30microM) in sezioni striatali. Come atteso, le concentrazioni di CP-55,940 inducono una stimolazione dose-dipendente dell’attività del recettore cannabico nello striato rispetto alla sezione non stimolata. Quando la salvinorina A viene coincubata con le differenti concentrazioni di CP-55,940 la stimolazione delle Gproteine non viene modificata dimostrando che la salvinorina non induce una modulazione allosterica né positiva né negativa del recettore CB1. Il passo successivo è stato quindi quello di verificare se potesse esistere un’interazione di tipo indiretto tra Salvinorina A e sistema cannabico ed in particolare abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla FAAH, l’enzima responsabile della degradazione dell’anandamide, uno dei principali agonisti endogeni del recettore CB1. Tramite un saggio enzimatico abbiamo valutato se la Salvinorina A potesse modulare l’attività della FAAH. Tale saggio è stato condotto sempre in membrane striatali utilizzando differenti concentrazioni di Salvinorina A (da 100 pM a 30 μM). La Salvinorina A induce una riduzione dell’attività della FAAH solo a determinate concentrazioni e senza un andamento dose-dipendente. In particolare si assiste ad una riduzione del 30% con la concentrazione 1 nM, del 23% con la 10 nM e del 26% con la 30 μM rispetto al controllo. Dai risultati ottenuti possiamo concludere che la Salvinorina A non si lega al recettore CB1 se non quando è presente in concentrazioni molto elevate (superiori a 10 μM). Inoltre il quadro di attivazione delle G proteine è quello di un agonista ĸ-oppioide, in quanto antagonizzato solo dalla nor-BNI. Infine la Salvinorina A non induce modulazione allosterica del recettore CB1. A concentrazioni relativamente basse come la 1 nM e la 10 nM la Salvinorina A è invece in grado di ridurre l’attività della FAAH, evento che potrebbe indurre un aumento del tono cannabico endogeno. Quindi accanto al già noto meccanismo di attivazione dei recettori ĸ-oppiacei la Salvinorina A potrebbe contemporaneamente incrementare i livelli di endocannabinoidi in specifiche aree cerebrali. Quest’ultimo evento potrebbe in parte spiegare le discrepanze osservate tra gli effetti indotti dai classici agonisti ĸ-oppioidi e quelli della Salvinorina A, nonché la capacità dell’SR141716A di antagonizzare alcuni effetti indotti da basse dosi di Salvinorina A. STUDI IN VIVO Poichè l’unità della Dott.ssa Sala ha dimostrato che basse dosi di salvinorina A inducono effetti ansiolitici ed antidepressivi nei ratti e gli studi in vitro hanno evidenziato che basse concentrazioni di Salvinorina A sono in grado di modulare negativamente l’attività della FAAH, il passo successivo è stato quello di verificare se la salvinorina A in vivo potesse alterare l’attività della FAAH nelle regioni cerebrali coinvolte nella modulazione dei comportamenti emotivi quali la corteccia prefrontale, l’ippocampo e l’amigdala. A tale scopo, sulle aree cerebrali provenienti da animali trattati in vivo con Salvinorina A alla dose di 10 microg/kg (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala) abbiamo condotto il saggio dell’attività della FAAH. Tale composto ha ridotto significativamente l’attività dell’enzima nell’amigdala, senza alterarla nelle due altre regioni cerebrali. Infine lo studio dei livelli dell’”immediate early gene” cFos ha permesso di mappare le aree cerebrali con alterata attività neuronale in seguito alla somministrazione di Salvinorina A alla dose ansiolitica e antidepressiva di 10 microg/kg. L’iniezione di tale composto ha ridotto significativamente l’espressione di c-fos nell’ippocampo. Un decremento nei livelli di cFos è inoltre presente nella corteccia prefrontale e nell’amigdala, anche se non raggiunge la significanza statistica. Non si evidenziano invece alterazioni nel caudato putamen e nel nucleo accumbens. Questi risultati suggeriscono un’azione della Salvinorina A in aree direttamente coinvolte nel circuito emozionale e suggeriscono una possibile interazione indiretta con il sistema cannabico a livello dell’amigdala.
Correlati cellulari e molecolari dell'abuso di Salvia divinorum: ruolo dei recettori cannabici e k oppioidi
RUBINO, TIZIANA
2006-01-01
Abstract
Compito della nostra unità di ricerca è stato quello di testare l’ipotesi di una possibile interazione della salvinorina A con il sistema cannabico. Questo scopo è stato perseguito tramite due differenti approcci sperimentali: in un primo momento sono stati eseguiti diversi saggi in vitro, atti ad identificare una possibile interazione diretta od indiretta tra la Salvinorina ed il recettore cannabico centrale CB1, nonché tra la salvinorina e la FAAH, l’enzima deputato alla degradazione del principale cannabinoide endogeno, l’anandamide. In un secondo momento, sui cervelli provenienti da animali trattati con salvinorina (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala), abbiamo valutato la capacità della salvinorina in vivo di alterare l’attività della FAAH, nonché quali fossero le aree cerebrali la cui attività neuronale fosse modulata dalla somministrazione in vivo di salvinorina. STUDI IN VITRO Sebbene una procedura di screening su cellule transfettate sembra indicare che la salvinorina A non è in grado di legare il recettore cannabico CB1, non esistono a tutt'oggi lavori di binding condotti su membrane cerebrali che confermino o meno tale risultato. Per studiare quindi la possibile esistenza di una interazione tra la Salvinorina A e il recettore cannabico centrale CB1 è stato condotto un saggio di binding di competizione, dove differenti concentrazioni di Salvinorina A competono per il legame con i recettori CB1 con una concentrazione fissa dell’agonista selettivo ad alta affinità [3H]CP-55,940 (1 nM). Le membrane sono state preparate dall’area striatale di ratti maschi Wistar, in quanto tale regione cerebrale contiene sia i recettori CB1 che i recettori k oppioidi. Per controllare la bontà delle condizioni sperimentali utilizzate, la competizione è stata condotta anche con concentrazioni crescenti di CP-55,940 non marcato e di un agonista k-oppioide, la spiradolina. Come atteso, le concentrazioni crescenti di CP-55,940 non marcato (da 1pM a 3μM) competono con l’agonista triziato per il legame al recettore CB1, ad ottenere una tipica curva di spiazzamento ad un sito di competizione con una IC50 di 3,9 nM (concentrazione di agonista che inibisce il 50% del binding specifico). Al contrario, concentrazioni crescenti di spiradolina (da 100 pM a 300 μM) non sono in grado di competere con il ligando triziato per il legame con il recettore CB1. Infatti nonostante si sia arrivati ad un eccesso molare di 300000 volte (300 μM di spiradolina vs 1 nM di [3H]CP-55,940), non si osserva nessun effetto significativo sul binding specifico del CP-55,940 triziato, ad indicare che il recettore CB1 non è un sito di legame della spiradolina, essendo questa un agonista selettivo del recettore κ-oppioide. Quando lo stesso esperimento viene condotto con concentrazioni crescenti di Salvinorina A, questo composto non presenta nessun effetto sul binding specifico del [3H]CP-55,940 fino alla concentrazione 10 μM, mentre a concentrazioni superiori (da 30 μM a 1 mM) compete con il ligando triziato per il legame al recettore CB1. La concentrazione di Salvinorina A che produce il 50% di inibizione del binding specifico è molto elevata (IC50 = 457.2 mM), suggerendo che forse questa interazione non è rilevante in quanto difficilmente raggiungibile in vivo. Inoltre in letteratura è riportato che l’SR141716A, antagonista selettivo dei recettori CB1, è in grado di antagonizzare l’effetto gratificante di basse dosi di Salvinorina A (Braida et al., 2007; 2008) mentre noi abbiamo evidenziato il legame di Salvinorina A al recettore CB1 solo a concentrazioni molto elevate. Poiché sia i recettori cannabici CB1 che κ-oppioidi sono accoppiati a G proteine per la trasduzione del segnale, abbiamo poi valutato la capacità della Salvinorina A di attivare tale via di trasduzione attraverso il saggio di binding del [35S]GTPγS condotto in autoradiografia. Abbiamo poi confrontato il quadro di attivazione della Salvinorina A con quello indotto da agonisti selettivi per il recettore CB1 (CP 55-940) e k oppioidi (spiradolina). A tale scopo, sezioni coronali a livello dell’area striatale sono state prima incubate con differenti concentrazioni di Salvinorina A (da 2.5 pM a 30 μM) per verificare con quale concentrazione questo composto fosse in grado di stimolare l’attività delle G proteine. La concentrazione più elevata di Salvinorina A (30 μM) era in grado di indurre una stimolazione del legame del [35S]GTPγS significativa (40%) rispetto alla sezione in assenza di stimolo, per cui abbiamo utilizzato tale concentrazione per le ulteriori indagini. Per indagare il coinvolgimento dei singoli recettori nell’attivazione delle G proteine stimolata da Salvinorina A, abbiamo condotto lo stesso saggio incubando la Salvinorina A 30 μM con i due rispettivi antagonisti, la nor-BNI 1 μM per il recettore κ-oppioide e SR141716A 10 μM per quello cannabico. A scopo comparativo abbiamo infine condotto lo stesso saggio stimolando l’attivazione delle G proteine con l’agonista selettivo per il recettore CB1 (CP-55,940 5 μM) e per quello κ-oppioide (spiradolina 10 μM). Come atteso, il CP-55,940 induce una stimolazione dell’attività del recettore cannabico nello striato del 76% rispetto alla sezione non stimolata, mentre la spiradolina produce una stimolazione dell’attività del recettore κ-oppioide del 38%. Questa differenza nella stimolazione delle G proteine è in linea con i dati di binding recettoriale presenti in letteratura che dimostrano come i recettori cannabici siano maggiormente espressi rispetto a quelli κ-oppioidi nell’area striatale (Tempel e Zukin, 1987; Herkenam et al., 1991; Rubino et al., 2003). La Salvinorina A induce una stimolazione delle G proteine del 36% (vs. non stimolato) ma quando incubata in vitro con la nor-BNI tale stimolazione si riduce e non è più significativamente differente dalla sezione non stimolata, dimostrando che il blocco farmacologico del recettore κ-oppioide previene la trasduzione del segnale da Salvinorina A. Quando invece questa è incubata con l’SR141716A la stimolazione è del 47%, simile a quella indotta dalla sola Salvinorina A, suggerendo che il blocco farmacologico del recettore cannabico non altera la stimolazione delle G proteine e che quindi tale sostanza a questa concentrazione attiva solo il recettore κ-oppioide. Dai risultati del binding recettoriale e del binding del [35S]GTPγS risulta quindi che la Salvinorina A si lega preferibilmente ai recettori κ-oppioidi. Poiché molto recentemente è stato scoperto che il recettore CB1, come molti altri recettori accoppiati a G proteine, contiene un sito di legame allosterico (Ross, 2007), da ultimo è stata valutata la capacità della salvinorina di agire come modulatore allosterico di questo recettore. Questa ipotesi è avvalorata dal fatto che è stato scoperto che la salvinorina può agire come modulatore allosterico del recettore oppiaceo mu (Rothman et al., 2007). A questo scopo abbiamo utilizzato nuovamente il saggio di binding del [35S]GTPγS stimolando con diverse concentrazioni dell’agonista cannabico CP-55,940 (2microM e 5microM) da solo o in coincubazione con salvinorina A (30microM) in sezioni striatali. Come atteso, le concentrazioni di CP-55,940 inducono una stimolazione dose-dipendente dell’attività del recettore cannabico nello striato rispetto alla sezione non stimolata. Quando la salvinorina A viene coincubata con le differenti concentrazioni di CP-55,940 la stimolazione delle Gproteine non viene modificata dimostrando che la salvinorina non induce una modulazione allosterica né positiva né negativa del recettore CB1. Il passo successivo è stato quindi quello di verificare se potesse esistere un’interazione di tipo indiretto tra Salvinorina A e sistema cannabico ed in particolare abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla FAAH, l’enzima responsabile della degradazione dell’anandamide, uno dei principali agonisti endogeni del recettore CB1. Tramite un saggio enzimatico abbiamo valutato se la Salvinorina A potesse modulare l’attività della FAAH. Tale saggio è stato condotto sempre in membrane striatali utilizzando differenti concentrazioni di Salvinorina A (da 100 pM a 30 μM). La Salvinorina A induce una riduzione dell’attività della FAAH solo a determinate concentrazioni e senza un andamento dose-dipendente. In particolare si assiste ad una riduzione del 30% con la concentrazione 1 nM, del 23% con la 10 nM e del 26% con la 30 μM rispetto al controllo. Dai risultati ottenuti possiamo concludere che la Salvinorina A non si lega al recettore CB1 se non quando è presente in concentrazioni molto elevate (superiori a 10 μM). Inoltre il quadro di attivazione delle G proteine è quello di un agonista ĸ-oppioide, in quanto antagonizzato solo dalla nor-BNI. Infine la Salvinorina A non induce modulazione allosterica del recettore CB1. A concentrazioni relativamente basse come la 1 nM e la 10 nM la Salvinorina A è invece in grado di ridurre l’attività della FAAH, evento che potrebbe indurre un aumento del tono cannabico endogeno. Quindi accanto al già noto meccanismo di attivazione dei recettori ĸ-oppiacei la Salvinorina A potrebbe contemporaneamente incrementare i livelli di endocannabinoidi in specifiche aree cerebrali. Quest’ultimo evento potrebbe in parte spiegare le discrepanze osservate tra gli effetti indotti dai classici agonisti ĸ-oppioidi e quelli della Salvinorina A, nonché la capacità dell’SR141716A di antagonizzare alcuni effetti indotti da basse dosi di Salvinorina A. STUDI IN VIVO Poichè l’unità della Dott.ssa Sala ha dimostrato che basse dosi di salvinorina A inducono effetti ansiolitici ed antidepressivi nei ratti e gli studi in vitro hanno evidenziato che basse concentrazioni di Salvinorina A sono in grado di modulare negativamente l’attività della FAAH, il passo successivo è stato quello di verificare se la salvinorina A in vivo potesse alterare l’attività della FAAH nelle regioni cerebrali coinvolte nella modulazione dei comportamenti emotivi quali la corteccia prefrontale, l’ippocampo e l’amigdala. A tale scopo, sulle aree cerebrali provenienti da animali trattati in vivo con Salvinorina A alla dose di 10 microg/kg (forniti dall’unità della Dott.ssa Sala) abbiamo condotto il saggio dell’attività della FAAH. Tale composto ha ridotto significativamente l’attività dell’enzima nell’amigdala, senza alterarla nelle due altre regioni cerebrali. Infine lo studio dei livelli dell’”immediate early gene” cFos ha permesso di mappare le aree cerebrali con alterata attività neuronale in seguito alla somministrazione di Salvinorina A alla dose ansiolitica e antidepressiva di 10 microg/kg. L’iniezione di tale composto ha ridotto significativamente l’espressione di c-fos nell’ippocampo. Un decremento nei livelli di cFos è inoltre presente nella corteccia prefrontale e nell’amigdala, anche se non raggiunge la significanza statistica. Non si evidenziano invece alterazioni nel caudato putamen e nel nucleo accumbens. Questi risultati suggeriscono un’azione della Salvinorina A in aree direttamente coinvolte nel circuito emozionale e suggeriscono una possibile interazione indiretta con il sistema cannabico a livello dell’amigdala.
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