Studio di linkage in famiglie di pazienti affetti da Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzia (CHI) mediante tecnologie di genotipizzazione ad alta risoluzione di SNP

L' Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzia (CHI, MIM # 256450) è una patologia grave caratterizzata da una inappropriata secrezione di insulina da parte delle beta-cellule pancreatiche, che causa severa ipoglicemia spesso pericolosa per la stessa vita del paziente. La patologia si presenta eterogenea dal punto di vista clinico, genetico, morfologico e funzionale e comporta un'estrema variabilità nell'età dell'esordio della malattia, nella severità con cui si manifesta e nella risposta alle cure mediche; è una delle principali cause di danni neurologici e diabete iatrogeno (Aynsley-Green 2000; Cosgrove 2004; Dunne 2005). Nei pazienti affetti da CHI sono state evidenziate mutazioni in differenti geni, ed è stata dimostrata un' ereditarietà di tipo sia autosomico recessivo che dominante (de Lonlay 2005; Henwood 2004). Circa il 50% casi sono causati da mutazioni sui geni ABCC8 (MIM # 600509) e KCNJ11 (MIM # 600937) che codificano per entrambe le subunità (KIR6.2 e SUR1) costituenti il canale del potassio ATP dipendente nelle beta--cellule (KATP). Circa il 5% dei pazienti affetti da CHI ha mutazioni dominanti nel gene che codifica per la glutammatodeidrogenasi (GDH) (Stanley 1998). Sono noti anche rari casi di CHI causata da mutazioni attivanti sul gene della glucokinasi (GCK) (Glaser 1998). Recentemente sono state trovate mutazioni nel gene dell'idrossi-L-3-acildeidrogenasi a catena corta (SCHAD) (Clayton 2001). E' stata anche descritta, in pochi pazienti, una sindrome singolare di ipoglicemia, conseguente all'esercizio fisico, la cui eziologia genetica rimane sconosciuta (Meissner 2001). Dal punto di vista istopatologico sono state distinte due diverse forme: si può avere un coinvolgimento diffuso delle beta-cellule nel pancreas (forma diffusa, Di-HI), o un'iperplasia adenomatosa focale (forma focale, Fo-HI), dove regioni distinte del pancreas appaiono essere coinvolte, mentre le aree circostanti sono istologicamente e funzionalmente normali. La forma diffusa della malattia è causata da mutazioni germinali e interessa l'intero corpo del pancreas (Goossens 1989). La forma focale invece è causata dalla perdita di una porzione del cromosoma materno (11p15) associata a mutazioni ereditate dall'allele paterno (Verkarre 1998). In questo panorama comunque, per circa il 50% dei pazienti affetti, non è stata ancora determinata un'eziologia genica precisa, suggerendo così l'ipotesi che altri geni ad oggi sconosciuti possano essere coinvolti. Sono stati proposti molti geni quali candidati (Sund 2001; Molven 2002; Ashcroft 2005) ad esempio fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo del pancreas, molti dei quali regolano anche la trascrizione di geni codificanti ormoni, oppure enzimi o recettori che intervengono nell' omeostasi del glucosio (Molven 2002). Vista la lunga lista di geni candidati i Polimorfismi a Singolo Nucleotide (SNPs) costituiscono dei marcatori validi per evidenziare nuovi loci genici nelle famiglie di pazienti con CHI, negativi per mutazioni, e quindi contribuire a comprendere il ruolo dei canali KATP dipendenti sull'eziologia di patologie che coinvolgano la funzionalità delle beta cellule (Ashcroft 2006). Gli SNPs rappresentano variazioni del genoma generate dalla mutazione di una singola base nel DNA e costituiscono la fonte più semplice e comune del polimorfismo genico nel genoma umano. Gli SNPs sono circa il 90% di tutti i polimorfismi del DNA e il singolo nucleotide alterato può essere compreso sia nelle regioni codificanti che in quelle non codificanti. La frequenza degli SNPs è di uno ogni 100-300 basi distribuite lungo i 3 miliardi di basiche costituiscono il genoma umano (The International HapMap Consortium 2005). Molti SNPs non influenzano la biologia o le funzioni fisiologiche dell'ospite, tuttavia i ricercatori ritengono che alcuni SNP favoriscano la predisposizione alla malattia o influenzino la risposta a farmaci ed altre terapie (Ventre 2001). L'avanzamento senza precedenti nella mappatura degli SNPs del genoma umano ha avuto un effetto notevole sul progresso della ricerca delle malattie genetiche. Le mappature degli SNPs stanno contribuendo ad identificare migliaia di marcatori lungo tutto il genoma facilitando l'analisi di mappe più grandi generate dai ricercatori nel Progetto Genoma che con la ditta "Celera Genetics" ha fornito, nel 2000, la descrizione completa del genoma umano (Ventre 2001; Goddard 2002). Da un punto di vista analitico, la possibilità di identificare marcatori multipli implica la necessità di applicare metodi statistici avanzati e strumenti bioinformatici applicati alla genetica molecolare per l'identificazione di correlazioni tra aplotipi e fenotipi in gruppi familiari. I test statistici multivariati, opportunamente corretti per limitare l'effetto delle comparazioni multiple sulle soglie di confidenza, possono essere applicati per individuare marcatori specifici e associazioni tra l' aplotipo di un locus e i geni che influenzano il fenotipo patologico (Di 2005; Liu 2003; Freimer 2005). Dai dati della letteratura si evince che l'analisi di SNPs ha contribuito ad identificare i geni multipli connessi con malattie complesse (Meaburn 2006; Carlson 2004) quali la malattia di Alzheimer (Strittmatter 1996), il diabete di tipo 2 (Altshuler 2000), il diabete di tipo I (Florez 2003) ed altre malattie autoimmuni (Ueda 2003). Queste associazioni sono difficili da rivelare con i metodi convenzionali di "gene-hunting" perché un singolo gene alterato può dare soltanto un piccolo contributo alla genesi della malattia. Parallelamente all'utilizzo degli SNPs per studi di associazione in malattie poligeniche si è pensato che questi marcatori potessero essere altrettanto validi se impiegati per l'analisi di linkage in malattie monogeniche (Matise 2000; Wilson 2000; Shepard 2000; Sellick 2004). Pochi studi fino ad ora hanno utilizzato l'analisi di SNPs per studi di linkage in patologie genetiche con trasmissione di tipo mendeliano, anche se molti studi supportano l'ipotesi che un set di SNPs ad alta densità possa fornire un numero di informazioni equiparabile a quelle ottenute con screening genomici che utilizzano altri marcatori quali microsatelliti o short-tandem-repeat polymorphisms (STRPs) (Wilson 2000; Matise 2003; Shepard 2004; Sellick 2004). Negli ultimi due anni tuttavia sono comparsi in letteratura studi che hanno utilizzato piattaforme ad alta densità di SNPs per individuare nuovi geni coinvolti in malatie autosomiche, sia dominanti che recessive, quali diabete neonatale, craniosinostosi, displasia renale (Sellick 2004), leucodistrofia di Pelizaeus-Merzbacher (Uhlenberg 2004), Congenital vertical Talus e Charcot-Marie Tooth (Shrimpton 2004) e microcefalia primaria (Shen 2005). Il sequenziamento dei geni candidati evidenziati con l'analisi di linkage ha permesso di riscontrare nei casi descritti la presenza di mutazioni puntiformi. In questo contesto di analisi genomiche si sono sviluppate negli ultimi anni numerose piattaforme (Affymetrix, Applied Biosystems, Illumina) per l'analisi simultanea di migliaia di SNPs, attraverso le quali é possibile identificare loci genici interessanti, associati a patologie a caratteri complessi (Butcher 2004). In particolare con i 2 Array che costituiscono il GeneChip Human Mapping 100K Set della ditta Affymetrix si possono analizzare contemporaneamente più di 100000 SNPs con un intervallo medio tra i vari marcatori di 23.6 Kb (Meaburn 2006; Matsuzaki 2004). Sulla base di queste considerazioni intendiamo utilizzare la piattaforma Affymetrix per lo studio della variabilità genetica e studio di linkage in famiglie di pazienti affetti da Iperinsulinismo Congenito dell'Infanzia