Meccanismi cellulari coinvolti nell’effetto anti-proliferativo ed anti-invasivo del cannabidiolo in cellule di glioma umano U87.

Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente dimostrato che il Cannabidiolo (CBD), costituente non psicoattivo della marijuana, possiede un effetto anti-proliferativo sia in vitro che in vivo su cellule di glioma umano U373 e U87 con un meccanismo indipendente dall’attivazione dei recettori cannabici CB1 e CB2 e del recettore dei vanilloidi TRPV1 (Massi P et al. 2004). Abbiamo inoltre dimostrato che alla base dell’effetto anti-tumorale del CDB vi è l’attivazione del processo apoptotico, tramite attivazione delle caspasi, e dei meccanismi di stress ossidativo, tramite l’aumento della produzione di ROS e decremento dei livelli di glutatione (Massi P. et al. 2006). Poiché i meccanismi biochimici alla base dell’effetto anti-proliferativo del CBD rimangono ancora da chiarire, nel presente lavoro di tesi abbiamo condotto saggi biochimici sia su tessuti tumorali excisi da topi nude immunodeficienti trattati in vivo con CBD che su cellule di glioma U87 trattate in vitro con CBD, al fine di valutare il possibile coinvolgimento del pathway delle lipoossigenasi e delle ciclo ossigenasi o del sistema endocannabinoide nell’effetto anti-tumorale di tale farmaco. I nostri risultati evidenziano che l’esposizione in vivo con CBD decrementa significativamente l’attività ed il contenuto della 5-LOX, mentre non si osserva nessuna variazione a carico della COX-2. Parallelamente risultano diminuiti i livelli di LTB4 ed inalterati i livelli di PGE2, rispettivamente i prodotti finali della 5-LOX e della COX-2. Il coinvolgimento della via lipoossigenasica è ulteriormente confermato dai dati ottenuti in vitro dove abbiamo dimostrato che l’inibitore selettivo per la 5-LOX, MK-886, utilizzato a concentrazioni subottimali, potenzia l’effetto anti-proliferativo del CBD. Contrariamente, né l’inibitore selettivo per la COX-2 celecoxib, né l’inibitore non selettivo per le COX indometacina, influenzano l’effetto anti-proliferativo del farmaco. Inoltre, il trattamento in vivo con CBD stimola in modo marcato l’attività dell’enzima principalmente coinvolto nell’idrolisi dell’endocannabinoide anandamide, la fatty acid amide hydrolase (FAAH) senza però alterare il suo contenuto proteico. Negli stessi tessuti tumorali exici abbiamo riscontrato una diminuzione significativa dei livelli di anandamide e della densità dei recettori cannabici. Esperimenti condotti da noi in vitro, hanno rivelato che il CBD induce un incremento dose-dipendente dell’attività della FAAH in cellule U87 ed, inoltre, cellule U87 overesprimenti la FAAH sono caratterizzate da una ridotta crescita nel tempo rispetto alle cellule controllo. Un secondo aspetto che abbiamo analizzato in questa tesi parte dall’evidenza che, durante la progressione tumorale, alcune cellule cancerose acquistano la capacità di staccarsi dalla massa primaria invadendo i tessuti circostanti sani e migrando così verso siti adiacenti dove formano nuove colonie. Recentemente, utilizzando il test della camera di Boyden, abbiamo dimostrato che il CBD inibisce la migrazione di cellule di glioma U87 a concentrazione non tossiche per le cellule stesse e attraverso un meccanismo indipendente dall’attivazione dei recettori cannabici e/o del recettore dei vanilloidi (Vaccani A. et al. 2005). Poiché la migrazione cellulare rappresenta un aspetto fondamentale nell’invasione tumorale, nella presente tesi abbiamo ulteriormente dimostrato, attraverso il wounding test, che il CBD inibisce la migrazione di cellule U87 già dopo 16h dall’inizio del trattamento. Inoltre, visto l’importante ruolo giocato dalle metalloproteinasi (MMP), enzimi rilasciati dalle cellule tumorali, nella degradazione della matrice extracellulare, abbiamo studiato il possibile coinvolgimento della MMP-2 nell’effetto anti-invasivo del CBD. I nostri risultati dimostrano che il CBD inibisce l’attività gelatino-litica delle forme attive della MMP-2 lasciando inalterata l’attività della pro-MMP-2. Successivamente, partendo dall’osservazione che nel nostro modello sperimentale di tumori excisi da topi nude immonodeficienti il CBD causa non solo una diminuzione della massa tumorale ma anche della vascolarizzazione della stessa, e visto che la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali verso la massa tumorale sono due importanti step nello sviluppo dell’angiogenesi tumorale, il nostro studio si è esteso a verificare un possibile coinvolgimento del CBD in questi processi. In particolare, i risultati ottenuti attraverso il test di vitalità cellulare (MTT) condotto su cellule endoteliali HUVEC trattate per 24 ore con CBD, hanno messo in luce la capacità di questo composto di inibire in maniera dose-dipendente la proliferazione di tali cellule. Inoltre, attraverso il test del wounding, abbiamo dimostrano che il CBD influenza in maniera dose-dipendente la capacità migratoria delle cellule HUVEC causando un significativo decremento del numero di cellule che invadono la fessura da noi creata artificialmente. A tal proposito è stato importante notare che tale effetto è esplicato alle stesse concentrazioni efficaci negli esperimenti condotti sulle cellule di glioma U87 e permane anche dopo 24 ore dopo il trattamento. In conclusione, i dati riportati nella presente tesi ampliano i risultati già ottenuti precedentemente e contribuiscono a chiarire le proprietà biochimiche e cellulari, sia in vivo che in vitro, del CANNABIDIOLO. In particolare, il sinergismo dimostrato con gli inibitori della 5-LOX, il coinvolgimento del sistema endocannabinoide e l’esistenza di un duplice effetto sia su cellule tumorali che endoteliali, rafforzano l’ipotesi che il CBD possa rappresentare un importante tool nella terapia dei gliomi.