Studio delle modificazioni instoniche e delle alterazioni trascrizionali indotte dal trattamento cronico con THC in adolescenza.

Il consumo di Cannabis fra gli adolescenti è sempre più diffuso ed il dibattito politico a favore della sua legalizzazione ribadisce la necessità di comprendere la relazione tra esposizione precoce alla Cannabis e successivo sviluppo di patologie psichiatriche. Studi condotti precedentemente nel nostro laboratorio hanno dimostrato che ratti femmine trattati cronicamente durante il periodo adolescenziale (35-45 post natal day o PND) con dosi crescenti dell’ingrediente psicoattivo della cannabis, il delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), sviluppano in età adulta un fenotipo simil depressivo-psicotico. Questo fenotipo non si sviluppa quando lo stesso trattamento viene condotto in età adulta, suggerendo quindi che l’adolescenza rappresenta un periodo particolarmente vulnerabile agli effetti avversi della cannabis. Tuttavia la neurobiologia di questa vulnerabilità rimane ancora poco chiara. Effetti come quelli indotti dal THC, che si sviluppano nel tempo e permangono anche a lungo, spesso richiedono cambiamenti dell’espressione genica ed è noto che un ruolo determinante nel modificare l’espressione genica è rivestito dai meccanismi epigenetici. Inoltre, un numero sempre maggiore di lavori dimostra il coinvolgimento dei meccanismi epigenetici nell’eziologia delle patologie psichiatriche. Sulla base di queste premesse, il primo obiettivo della presente tesi è stato quello di valutare se il trattamento cronico con THC in adolescenza fosse in grado di indurre alterazioni delle modificazioni istoniche. A tale scopo ratti femmine adolescenti (PND 35) del ceppo Sprague-Dawley sono stati trattati due volte al giorno, per 11 giorni, con iniezioni intraperitoneali (ip) di dosi crescenti di Δ9-THC: 2.5 mg/kg (35-37 PND), 5 mg/kg (38-41 PND), 10 mg/kg (42-45 PND), o del rispettivo veicolo. Due, 24 e 48 ore dalla fine del trattamento, tramite saggi di Western blot, sono state valutate alcune delle modificazioni epigenetiche più coinvolte nello sviluppo delle malattie psichiatriche. In particolare sono state investigate le modificazioni dell’istone H3, tra cui le metilazioni della lisina 9 e 27 (marker di repressione genica) e le acetilazioni della lisina 9 e 14 (marker di attivazione genica). I saggi sono stati condotti a livello della corteccia prefrontale, un’area particolarmente importante per la modulazione del comportamento emotivo. I risultati ottenuti dimostrano che il trattamento cronico con THC in adolescenza è in grado di alterare il normale rimodellamento della cromatina, inducendo cambiamenti nelle modificazioni istoniche che avvengono a livello della corteccia prefrontale. Queste alterazioni sono già visibili subito dopo 2 ore dalla sospensione del trattamento con un incremento dei livelli di H3K9me3 (25%). Tale incremento diventa più intenso (48%) a 24 ore dall’ultima somministrazione di THC ed è accompaganto da un incremento significativo dei livelli di H3K9me2 (25%). Oltre alle alterazioni dei marker associati a repressione genica, a 24 ore dall’ultima iniezione di THC si evidenziano anche alterazioni dei livelli di H3K14Ac (26%), un marker associato ad attivazione trascrizionale. Queste alterazioni risultano essere transienti in quanto non sono più presenti 48 ore dopo la sospensione del trattamento A scopo comparativo, lo stesso schema di trattamento e le stesse analisi sono state condotte in animali adulti (75-85 PND). I risultati ottenuti hanno mostrato che, a 2 ore dalla fine del trattamento, si osserva un incremento significativo dell’H3K9me3, come quello osservato in seguito all’esposizione adolescenziale, ma al contrario di quanto osservato negli animali adolescenti, in tutte le tempistiche successive (2 e 24 ore) non vi è nessuna alterazione significativa. Complessivamente, i risultati ottenuti supportano l’ipotesi che la H3K9me3 sia una delle principali modificazioni istoniche compromesse dall’esposizione cronica al THC e che questo effetto sia indipendente dal periodo di esposizione, mentre l’incremento di H3K9me2 e di H3K14ac siano specificatamente dovute all’esposizione adolescenziale. Dato che le modificazioni epigenetiche si riflettono sulla trascrizione genica, il secondo scopo della seguente è stato quello di valutare se il trattamento cronico con THC induce alterazioni trascrizionali a livello della PFC degli animali adolescenti. L’evento biologico che caratterizza il cervello adolescente è l’intenso rimodellamento sinaptico ed il sistema endocannabinoide sembra giocare un ruolo importante nel controllo dei meccanismi di plasticità sinaptica. Sulla base di queste evidenze, sono stati condotti saggi di Real-Time PCR per valutare il profilo di espressione di geni del sistema endocannabinoide e di geni direttamente o indirettamenti coinvolti nei processi di plasticità sinaptica. Più specificatamente sono stati valutati geni del sistema endocannabinoide (Cnr1, Faah, Mgll, Ppara e Pparg), geni appartenenti al sistema glutammatergico (Gria1, Gria2, Grin1, Grin2a, Grin2b, Grm1, Grm2, Grm3 e Grm5), GABAergico (Gabbr1, gabbr2, Gabra1, gabra2, Gabrb1, Gad1 e Abat) e serotoninergico (Htr2a), di geni codificanti per enzimi coinvolti nelle modificazioni epigenetiche (Sirt1) e codificanti per proteine direttamente coinvolte nei processi e nelle pathway di rimodellamento sinaptico (Dlg4, Bdnf, Ntrk12, Camk2a, Camk2g, Pdyn, Prkaca, Nos1, Creb1, Homer1, Pick1, Synpo, Crebbp, Arc, Reln e Adcy1). Per studiare il time-course delle possibili alterazioni trascrizionali e la loro persistenza, i saggi sono stati condotti a 2, 24 e 48 ore dall’interruzione del trattamento e al PND 75. I risultati ottenuti dall’analisi dei trascritti mostrano un quadro di generale downregolazione indotto dal trattamento adolescenziale con THC. Questo effetto si manifesta già a due ore dalla fine del trattamento e diventa più intenso e ampio a 24 ore, dove 17 trascritti su 37 sono significativamente ridotti. Questo forte e generale effetto di downregolazione osservato fino a 24 ore dalla fine del trattamento, a fronte delle alterazioni osservate a livello istonico, potrebbe essere giustificato dall’incremento di di- e tri-metilazione della lisina 9 dell’istone H3, osservato nelle stesse tempistiche. Al contrario, a 48 ore dall’ultima iniezione, il quadro appare ben diverso: tutti i messaggeri vengono riportati a controllo o sono significativamente aumentati. A sua volta, questo recupero potrebbe essere mediato a livello istonico dall’incremento di acetilazione. È quindi ipotizzabile che in seguito al grosso effetto di repressione genica indotto dal trattamento cronico con THC, il cervello adolescente risponda innescando un meccanismo atto a cotrobilanciare la downregolazione osservata. Per valutare se negli animali pre-esposti al THC durante il periodo adolescenziale le alterazioni a carico dei livelli di messaggero fossero alterazioni persistenti o transienti, lo stesso pannello di analisi è stato condotto a 30 (PND 75) giorni dall’ultima iniezione di THC, quando il fenotipo simil depressivo-psicotico è presente. I risultati ottenuti al PND 75 indicano che 8 geni risultano essere significativamente alterati. Tra questi vi sono i messaggeri di Gria1, Gria2, Grm3, Gabra1, Abat, Dlg4 e Ntrk12 che sono significativamente incrementati, mentre solo il messaggero del gene Reln, che codifica per la Relina, risulta essere fortemente downregolato. È probabile che la maggior parte degli eventi innescati dal trattamento cronico con THC in adolescenza vengano recuperati al raggiungimento dell’età adulta, fuorchè i livelli trascrizionali di alcuni geni, tra cui Gria1 e Reln, che sono particolarmente interessanti per il fenotipo mostrato da questi animali, in quanto sembrano giocare un ruolo importante nei disturbi psichiatrici. Sempre a scopo comparativo, lo studio del profilo genico è stato condotto negli animali adulti. Il profondo effetto di downregolazione osservato a 24 ore dall’ultima iniezione di THC negli animali adolescenti, non è stato riscontrato quando lo stesso trattamento è stato condotto in età adulta. Infatti, osservando i dati ottenuti dall’analisi degli stessi geni negli animali trattati durante l’età adulta, solo i messaggeri di 5 geni risultano essere significativamente ridotti: Ppara, Grm2, Pick1 e Reln, mentre solo il gene che codifica per Bdnf risulta essere significativamente incrementato rispetto agli animali controllo. Per quanto riguarda il trattamento in età adulta, è quindi evidente che il THC non sia in grado di indurre modificazioni dei trascritti così profonde come quelle osservate in seguito al trattamento in adolescenza. Dato che il principale evento epigenetico indotto dall’esposizione cronica al THC è l’incremento dei livelli di H3K9me3, l’obiettivo successivo è stato quello di valutare l’espressione dell’enzima responsabile della trimetilazione dell’H3K9 Suv39h1, in seguito al trattamento adolescenziale con THC. I risultati ottenuti ci hanno mostrato che 2 e 24 ore dopo l’ultima iniezione di THC, i livelli di Suv39h1 sono significativamente aumentati nella corteccia prefrontale, suggerendo che l’incremento di trimetilazione dell’H3K9, osservato 2 e 24 ore dopo il trattamento adolescenziale con THC, sia la diretta conseguenza dell’incremento di Suv39h1. Infine, l’ultimo obiettivo di questa tesi è stato quello di comprendere il ruolo svolto dall’incremento di H3K9me3 nello sviluppo del fenotipo simil depressivo-psicotico indotto dall’esposizione adolescenziale al THC. A tale scopo gli animali adolescenti esposti al THC sono stati co-trattati con il farmaco epigenetico Chaetocin, un inibitore dell’enzima Suv39h1. I test comportamentali condotti al PND 75, time-point in cui gli animali raggiungono l’età adulta e si sviluppa il fenotipo simil depressivo-psicotico, dimostrano che il co-trattamento con Chaetocin è in grado di prevenire i deficit cognitivi indotti dall’esposizione adolescenziale al THC, ma non quelli della sfera emotiva. In conclusione, i risultati presentati in questo progetto di tesi indicano che l'esposizione adolescenziale alla cannabis agisce a livello epigenetico inducendo alterazioni delle modificazioni istoniche. Tali modifiche si ripercuotono a livello trascrizionale causando alterazioni a breve e a lungo termine di specifici geni coinvolti nei processi di plasticità sinaptica. Gli effetti osservati sia a livello istonico che trascrizionale sembrano essere età-dipendenti, indicando una maggiore vulnerabilità del cervello adolescente agli effetti avversi della cannabis. I nostri risultati supportano inoltre il coinvolgimento, almeno in parte, della trimetilazione della lisina 9 sull’istone H3 nello sviluppo delle alterazioni comportamentali osservate negli animali adulti pre-esposti al THC. Infatti, la somministrazione durante l’esposizione adolescenziale al THC di un inibitore dell’enzima Suv39h1, l’enzima responsabile di questa modificazione, previene la comparsa dei deficit cognitivi osservati in età adulta. Studi futuri saranno necessari per ricercare quali meccanismi epigenetici possano essere coinvolti nello sviluppo dei deficit della sfera emotiva indotti dall’esposizione adolescenziale al THC.