Ruolo degli agenti microbici nella eziopatogenesi delle vasculopatie e del diabete. Studi su cellule endoteliali vascolari e nuovi target terapeutici di intervento.

MODULAZIONE GENICA E FUNZIONALE DI CELLULE ENDOTELIALI ARTERIOSE E VENOSE INFETTATE IN MODO PERSISTENTE DA COXSACKIEVIRUS B: POSSIBILE RUOLO NEI PROCESSI DI TROMBOGENESI E ATEROSCLEROSI I processi infiammatori svolgono un ruolo di rilievo nella genesi e nella progressione delle lesioni croniche cardiovascolari di natura sia aterosclerotica sia trombotica ed è noto che le alterazioni endoteliali giocano un ruolo centrale in tali processi patologici. In tale ottica deve essere rivalutato il coinvolgimento da tempo ipotizzato degli agenti microbici nella patogenesi dell’aterosclerosi. Tra i microrganismi che sembrano giocare un ruolo nella eziologia dell’aterosclerosi sono compresi sia virus (CMV, HSV, EBV) che batteri (Chlamydia pneumoniae e Helicobacter pylori). Recentemente è stata evidenziata una possibile correlazione tra aterosclerosi, infarto del miocardio e coxsackievirus B (CVBs), agenti virali appartenenti alla famiglia dei Picornaviridae, coinvolti nella eziologia di processi patologici di tipo cronico degenerativo e di cui abbiamo da tempo dimostrato la capacità di infettare le cellule endoteliali (ECs). Poiché le ECs presentano caratteristiche differenti a seconda dell’origine, abbiamo indagato gli effetti funzionali dei CVBs su linee di cellule endoteliali venose e arteriose ottenute e caratterizzate nel nostro laboratorio. L’attività di ricerca si è incentrata sullo studio della interazione tra il ceppo cardiotropico CVB3 e le cellule endoteliali umane e sulla caratterizzazione degli effetti dell’infezione sulle funzioni di tali cellule correlate allo sviluppo di infiammazione e alla regolazione della coagulazione. Lo studio è stato effettuato principalmente su un modello di infezione in vitro di cellule endoteliali vascolari umane immortalizzate il cui fenotipo è stato caratterizzato sulla base dell’espressione di antigeni endotelio-specifici. I recettori dei CVBs (CAR e CD55) sono espressi sia in ECs venose che arteriose ed entrambi i tipi cellulari sostengono una infezione persistente produttiva non citopatica da CVB3. Gli effetti dell’infezione sono stati indagati mediante DNA microarray specifici per pathways funzionali endoteliali e confermati mediante RTPCR semiquantitative, test immunoenzimatici e citofluorimetria. I risultati dimostrano che CVB3 stimola nelle ECs un’aumentata espressione delle citochine pro-infiamatorie IL-1, IL-6 e IL-8. L’incremento è maggiore nelle ECs arteriose, nelle quali si osserva inoltre up regolazione delle chemochina MCP-1, della proteina C reattiva (CRP), di INF-1 e di COX-2, un enzima chiave nelle fasi precoci del processo infiammatorio. In entrambi i tipi di ECs l’infezione determina una down-regolazione delle caderine e delle integrine, molecole particolarmente importanti in quanto coinvolte nella disregolazione delle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che predispone il tessuto vascolare alla formazione di placche ateromasiche instabili e alla trombosi. A carico delle ECs venose CVB3 altera in senso pro-trombotico le funzioni di regolazione della coagulazione, con riduzione dell’espressione dell’ attivatore tessutale del plasminogeno e down-regolazione dell’ inibitore dell’ attività procoagulativa del fattore tessutale. A carico delle ECs arteriose l’effetto pro-aterosclerotico di CVB3 è stato confermato dall’ induzione di IL-18 e INF-, fattori condizionanti lo sviluppo e l’instabilità delle placche ateromasiche e dall’ aumentata espressione delle molecole di adesione e attivazione leucocitaria ICAM-1 e VCAM-1. Allo scopo di provare a identificare nuovi target terapeutici di intervento abbiamo sottoposto, in modo preliminare, le nostre ECs a trattamento con statine. La somministrazione di simvastatina determina nelle ECs infettate una riduzione del “virus yield”, evidenziata dal diminuito rilascio di particelle virali infettanti e dalla ridotta presenza di genoma B3 intracellulare. Inoltre si osserva down regolazione di alcuni importanti markers pro infiammatori (IL-1IL-6, INF-, INF-1 e CRP) con effetti più evidenti nel caso di ECs arteriose infettate. I risultati ottenuti dimostrano come CVB3, virus con tropismo cardiovascolare, possa modulare in modo assai complesso le attività funzionali delle ECs e possa rappresentare un modello per analizzare il ruolo dei CVBs, o di altri virus, nello sviluppo di processi infiammatori cronici vascolari ad esito trombotico e/o aterosclerotico e conseguente sviluppo dello studio di nuove prospettive terapeutiche. MALATTIA PARODONTALE E ATEROSCLEROSI: CORRELAZIONI MICROBIOLOGICHE Da qualche anno si parla sempre più spesso di una correlazione tra salute orale e alcune importanti malattie sistemiche, infatti numerosi studi epidemiologici condotti negli ultimi dieci anni hanno dimostrato come persone che soffrono di malattie parodontali possano manifestare con maggiore frequenza patologie cardiovascolari, diabete, malattie polmonari e nascite premature. Uno dei potenziali meccanismi alla base dell’associazione tra salute parodontale e malattie sistemiche è rappresentato dalla infezione batterica. Diversi studi hanno suggerito una possibile associazione tra periodontiti, batteri parodonto patogeni e lo sviluppo di malattie cardiovascolari. Studi sperimentali hanno dimostrato l’abilità di batteri parodonto patogeni nell’interagire con le cellule endoteliali, nell’indurre proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari e nel causare un rilascio locale di citochine proinfiammatorie. La presenza di questi batteri a livello delle placche aterosclerotiche potrebbe avere un ruolo di rilievo nelle fasi di iniziazione, sviluppo e progressione del processo aterosclerotico stesso. Fino ad ora non sono state trovate e presentate in letteratura delle evidenze complete e molti studi su questa associazione dovrebbero essere ancora condotti. Nel corso di questo studio sperimentale sono stati reclutati una ventina di pazienti per essere sottoposti ad endoarterioectomia, prelievi parodontali/gengivali e di sangue. Tutti i campioni sono stati adeguatamente trasportati, conservati e processati per essere sottoposti ad estrazione di DNA totale e batterico in base a specifici protocolli ottimizzati. Si è proceduto mediante specifiche indagini di biologia molecolare con un approccio di PCR di tipo Multiplex con cui poter individuare in una singola reazione più frammenti di DNA batterico per ciascun campione attraverso l’uso di coppie di primers specifici per i batteri da noi precedentemente selezionati (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis). La valutazione di tutte le analisi PCR Multiplex condotte e soprattutto l’accurata osservazione dei rispettivi gels ad esse associate, ci ha permesso di ottenere una serie di risultati preliminari. Dei 20 tamponi parodontali testati tutti infatti sono risultati positivi per Fusobacterium nucleatum (100%), il 70% ha mostrato positività per Prevotella intermedia, il 65% per Porphyromonas gingivalis, mentre il 30% per Actinobacillus actinomycetemcomitans e infine il 10% per Bacteroides forsythus. Delle 20 placche analizzate il 35% sono risultate positive per Fusobacterium nucleatum, il 15% per Prevotella intermedia e il 5% per Porphyromonas gingivalis così come per Actinobacillus actinomycetemcomitans. Le indagini condotte su campioni di sangue intero hanno rilevato una batteriemia in circa il 35% dei casi e di cui il 20% ad opera di Fusobacterium nucleatum, il 5% di Prevotella intermedia così come di Porphyromonas gingivalis. In seguito ad analisi globale e comparativa di tutti i risultati ottenuti nel caso dei tre tipi di campioni indagati, abbiamo evidenziato come in tre pazienti vi sia del DNA batterico in tutti i campioni da loro prelevati (tampone parodontale, placca aterosclerotica e sangue) e in particolar modo come Fusobacterium nucleatum sia generalmente il battere più rappresentato. In modo preliminare abbiamo quindi ottenuto delle prime indicazioni con cui poter affermare che le placche siano state colonizzate da batteri parodonto patogeni entrati in circolo e che il DNA in esse ritrovato non sia dovuto a semplici batteriemie transienti o a contaminazioni tecnico/operative. Ulteriori indagini hanno evidenziato la presenza del genoma di Chlamydia pneumoniae nel 54% degli ateromi. Il genoma di Enterovirus è stato isolato nel 14% delle placche aterosclerotiche. Tre pazienti hanno rilevato a livello delle loro placche aterosclerotiche un evidente “pathogen burden” (Porphyromonas gingivalis+Fusobacterium nucleatum+Chlamydia pneumoniae+enterovirus) correlato positivamente con una maggiore condizione infiammatoria della placca come dimostrato dalla elevata espressione di citochine e chemochine pro-infiammatorie (IL-6, IL- 1, IL-8, MCP-1) e della proteina C reattiva (CRP), a conferma del ruolo, sempre più evidente, che i microrganismi giocano nella eziopatogenesi dell’aterosclerosi. I COXSACKIEVIRUS B POSSONO INDURRE DIABETE ATTRAVERSO L’INFEZIONE DELLE CELLULE ENDOTELIALI DELLE ISOLE DI LANGERHANS DEL PANCREAS Il diabete di tipo 1 (TD1) è dovuto ad un danno delle cellule produttrici di insulina per lo più conseguente all’attivazione di processi cronici di natura infiammatoria e immunologica e mediato dal rilascio di citochine nelle isole di Langerhans. I virus (in particolare Coxsackievirus B4, CVB4) sono ritenuti possibili cause di diabete, ma i meccanismi patogenetici non sono stati finora chiariti. Gli enterovirus causano frequentemente viremia e diffusione a vari organi viscerali tra cui anche il pancreas. Dati siero epidemiologici suggeriscono che molti pazienti con diabete di tipo 1 sono positivi per Coxsackievirus, in particolar modo per CVB4. Studi attuali hanno dimostrato che pazienti con TD1 recente mostrano titoli virali e CVB-IgM più elevati, soprattutto per il sierotipo B4, rispetto a soggetti non diabetici. Il meccanismo attraverso il quale gli enterovirus contribuiscono alla distruzione delle cellule _ pancreatiche rimane ancora da stabilire e per ora possono essere formulate solo delle ipotesi. Le cellule del microcircolo (MVECs) svolgono un ruolo chiave nei processi fisiopatologici insulari che portano al diabete. La capacità delle MVECs di presentare antigeni insulari ai linfociti T citotossici specifici (GAD65, proinsulina e tirosina fosfatasi IA-2), di esprimere molecole di adesione (ICAM-1, VCAM-1, integrine) e di produrre tutta una serie citochine e chemochine, le rende protagoniste nei processi di distruzione autoimmunitaria delle cellule beta pancreatiche. Poiché il nostro gruppo ha dimostrato che i CVBs possono infettare in modo persistente le cellule endoteliali con attivazione di processi infiammatori cronici, abbiamo indagato la suscettibilità delle MVECs insulari a CVB4 e gli eventuali effetti pro-diabetogeni indotti dall’infezione. A tale fine abbiamo allestito colture primarie di MVECs insulari da cui abbiamo sviluppato linee immortalizzate con SV40 fenotipicamente omogenee, stabili, a rapida espansione, con morfologia analoga alla coltura primaria e con importanti caratteristiche biologiche tipiche delle cellule parentali. Le colture immortalizzate mostrano inoltre somiglianza a quelle primarie da un punto di vista funzionale nell’espressione delle molecole di adesione, nell’aderenza dei linfomonociti e nelle funzioni di barriera. Le MVECs insulari sono state caratterizzate in base all’espressione di markers endoteliali specifici e ne è stato valutato il profilo immunologico. Entrambi i tipi di coltura se messi su substrato di matrigel formano strutture simili a cordoni capillari. Le MVECs insulari mostrano una elevata espressione basale per ICAM-1, una moderata espressione di E-selectina e una non rilevabile espressione di VCAM-1. Il trattamento con TNF-up-regola l’espressone di ICAM- 1 e E-selectina e induce neo espressione di VCAM-1. Il trattamento con INF-induce l’espressione di HLA-DR (molecola HLA di classe II). Le prove di infezione hanno dimostrato CVB4 replica in modo persistente nelle MVECs insulari con rilascio di virus infettante, ma in assenza di un effetto citopatico rilevante. A carico delle MVECs insulari infettate sono stati riscontrati effetti pro-infiammatori persistenti in termini sia di iper espressione di molecole di adesione (ICAM-1, VCAM-1 e integrine 53) sia di produzione di citochine/chemochine (IL-1, IL-6, IL-8, INF-, INF-, TNF-, linfotactina). E’ da rilevare che tali mediatori non solo svolgono un ruolo decisivo nella patogenesi immuno-mediata del diabete, ma possono anche danneggiare in modo diretto le cellule . Nelle fasi iniziali dell’infezione è stato rilevato rilascio di IL-18, citochina inducente INF-, altro importante mediatore del danno insulare. Dato di particolare interesse è stato il riscontro dell’espressione nelle MVECs insulari infettate di Fas-L, fattore decisivo nei processi di apoptosi a carico delle cellule . E’ possibile pertanto concludere che l’infezione delle MVECs insulari da parte di CVB4 determina in modo sia indiretto che diretto l’attivazione di meccanismi di danno delle cellule produttrici di insulina. I risultati e le osservazioni, condotti in questi tre anni di ricerca, hanno reso le cellule endoteliali vascolari ECs interessanti e sicure protagoniste nella patogenesi delle vasculopatie e del diabete di tipo 1 in corso di infezioni acute e/o persistenti sia di natura virale che batterica. I dati fino ad ora ottenuti potrebbero indurre tutta una serie di studi finalizzati ad esplorare nuovi approcci terapeutici e proprio l’analisi dei cambiamenti molecolari delle ECs durante i processi di infezione/infiammazione potrà aiutare a identificare i nuovi target di intervento per malattie diffusissime come l’aterosclerosi e il diabete.