CDKL5 e sindrome di Rett: un approccio molecolare per la definizione di una correlazione genotipo/fenotipo.

La sindrome di Rett è una grave malattia del neurosviluppo legata al cromosoma X che colpisce principalmente individui di sesso femminile. Le bambine affette da sindrome di Rett subiscono uno sviluppo postnatale apparentemente normale fino all'età di 6-18 mesi, per poi manifestare un marcato declino neurologico con decorso molto variabile. Circa il 25% delle pazienti sono affette da forme atipiche che si discostano dalla forma classica o per il fatto di essere più blande con un iter meno devastante o per un fenotipo più “aggressivo” con insorgenza precoce che può portare anche a crisi epilettiche non trattabili farmacologicamente. La maggior parte dei casi di forma classica di Rett è causata da mutazioni nel gene MECP2, un repressore trascrizionale espresso maggiormente nel cervello che lega il DNA metilato e che causa la formazione di una struttura cromatinica compatta e trascrizionalmente inerte. Circa solo il 50% delle pazienti con varianti della sindrome di Rett però sono portatrici di mutazioni in questo gene. Per questa classe di fenotipi sono state descritte nel 2004 mutazioni a carico del gene CDKL5 codificante per una serin-treonina chinasi e nel 2008 altre a carico del gene FOXG1, un fattore trascrizionale. La ricerca scientifica ha quindi ampliato i propri obbiettivi al fine di comprendere se questi tre geni, apparentemente diversi fra loro, potessero essere accomunati da uno stesso pathway molecolare. A tutt'oggi però i risultati sono ancora scarsi e, a volte, contraddittori. Per quanto riguarda gli studi su CDKL5, un aspetto generalmente accettato risiede nel fatto che in tutti i casi l'attività catalitica di CDKL5 appare di estrema importanza. Con questa premessa, sarebbe quindi interessante osservare con quale modalità le mutazioni a carico di CDKL5 possano influire sulla sua funzione enzimatica. L'obbiettivo della mia ricerca è stato quello di analizzare otto mutazioni puntiformi (A40V, N71D, V132G, R178W, W195R, E203D, L220P e T288I) giacenti sul dominio catalitico di CDKL5. Queste mutazioni sono state riscontrate in pazienti con la variante Hanefeld. Per ogni mutazione è stata valutata la localizzazione cellulare e l'attività chinasica sul motivo TEY. Inoltre, grazie all'ausilio di strumenti bioinformatici, è stato creato un modello tridimensionale del dominio chinasico di CDKL5 ed è stato possibile predire l'influenza che ogni mutazione ha sulla struttura della proteina. L'analisi di localizzazione subcellulare ci ha permesso di concludere che in generale le mutazioni a carico del dominio catalitico non influenzano in maniera significativa la distribuzione di CDKL5 all'interno della cellula, a differenza delle mutazioni troncanti sulla coda carbossiterminale, precedentemente analizzate nel nostro laboratorio. Ciononostante per le mutazioni W195R e E203D si è osservato un accumulo della proteina nel compartimento citoplasmatico. E' stata inoltre osservata la perdita della tipica organizzazione in dots di CDKL5. Le analisi bioinformatiche collocano questi due residui nell' α-elica F del sottodominio IX del dominio chinasico della proteina. A quest'elica, comune alle MAP chinasi, era già stata precedentemente attribuita una cruciale importanza nell'orchestrazione dell'attività chinasica. E' quindi possibile che una sua precisa conformazione spaziale sia necessaria per una corretta interazione con le altre proteine e per una altrettanto corretta distribuzione della proteina all'interno della cellula. L'analisi dell'attività catalitica invece ha permesso di evidenziare che le mutazioni in esame possono portare a perdita totale di fosforilazione (A40V), a una sua diminuzione (V132G, R178W, W195R, E203D, L220P e T288I) oppure a nessun effetto evidente (N71D). Per questa mutazione perciò è stato proposto un saggio di stabilità che ha evidenziato un'emivita minore rispetto alla forma canonica, dando un'ulteriore prova di come i livelli di CDKL5 probabilmente debbano essere finemente regolati per una sua corretta funzionalità neuronale. Nell'ultimo periodo del mio dottorato ho avuto inoltre la possibilità di valutare un ipotetico ruolo di CDKL5 nella maturazione neuronale, in quanto è stata osservata la sua presenza a livello dei centrosomi in cellule proliferanti fissate in metafase. E' ormai assodato il ruolo del centrosoma nelle tre fasi della maturazione neuronale e perciò ho approfondito questo aspetto verificando la colocalizzazione di CDKL5 nel centrosoma anche in colture di neuroni corticali in via di maturazione. Questa scoperta non chiarisce con certezza quale sia lo specifico ruolo di CDKL5 in questo fenomeno ma offre sicuramente una nuova chiave di lettura per stabilire quale meccanismo neuronale venga a mancare nelle pazienti portatrici di difetti in questo gene.